GSR公开课第三十七讲：同位素方法在POPs污染土壤
微生物修复研究中的若干应用
主讲人：吴宇澄 副研究员
（2023年9月14日）
吴宇澄，博士，中国科学院南京土壤研究所副研究员，硕士研究生导师。研究方向为士壤中持久性有机污染物的微生物降解原理与污染土壤修复。近年来，注重采用同位素方法并结合微生物组学研究技术，对土壤中有机污染物的环境归趋与微生物转化原理开展研究。近5年来，在有机氯农药、多环芳烃、多溴联苯醚等持久性有机污染物的微生物共代谢降解机制、化学-微生物联合修复机制等方面取得了系列进展。以第一或通讯作者发表SCI论文20余篇，授权发明专利1项。先后主持国家自然科学基金项目4项，国家重点研发项目课题1项。
课程概要：
质子数相同而中子数不同的同一元素的不同核素互称为同位素。同位素因其特殊性质，已被广泛用于医学、考古、水文地质等不同领域。在土壤环境研究中，同位素标记、同位素分馏等方法也具有不可替代的作用。近年来，我们运用同位素方法在POPs污染土壤生物修复方向开展了系列工作，主要包括：（1）利用同位素示踪技术研究微生物共代谢原理以及化学修复中的微生物作用；（2）通过稳定性同位素探针技术（SIP）追踪土壤中的关键降解菌；（3）探讨单体化合物同位素分析技术（CSIA）在土壤修复效果评价中的前景。本次报告将从原理、应用等方面对上述技术进行介绍，并结合具体案例展示多种方法联用对POPs污染土壤修复所起的支撑作用。
课程内容：
一、同位素基础
（一）原子的构成
图 1 原子的构成
1、同位素：质子数相同、中子数不同的同一元素原子，互为同位素。
2、性质：同位素的化学性质相同，但涉及原子核的某些物理性质不同。
（二）同位素的性质（以碳同位素为例）
1、稳定性差异：14C（放射性同位素） 与 12C/13C（稳定同位素）
2、质量差异：13C重、12C轻
3、丰度差异： 12C（98.9%）、 13C（1.1%）、 14C（极微量，<0.1%）
图 2 碳同位素性质图示
二、同位素示踪-污染物
（一）利用同位素信号追踪污染物降解
1、原理：用液体闪烁计数器（LSC）检测同位素信号
2、优点：灵敏、准确（可以解决常规方法测定精度不足问题）
3、缺点：不直接反映污染物浓度变化（除CO2）
图 3 污染物降解
基于同位素示踪法的测定，总结出土壤中有机污染物的环境归趋。随着时间的推移，土壤中的部分污染物部分污染物被彻底矿化为二氧化碳的形式；另一部分污染物会被土壤中的有机质吸附成为结合残留的状态；少量污染物会被微生物吸收并转化为微生物的组成部分（如：生物大分子）；剩余污染物即可提取的残留物。
（二）应用
1、多环芳烃-木质素共代谢机制研究
（1）利用碳同位素示踪，取得了木质素促进多环芳烃共代谢的可靠证据（Wu，et al.，2018）
（2）同位素示踪+选择性抑制，明确土壤真菌的关键作用（Pan，et al.，2019）
（3）同位素示踪+宏基因组分析，推断土壤细菌参与芳烃降解（Sun，et al.，2020）
（4）同位素示踪+选择性抑制+宏基因组，提出土壤真菌-细菌接力共代谢降解多环芳烃作用模式（Gu，et al.，2022）
（5）建立了木质素-表面活性剂-植物复合修复技术；多环芳烃总体去除率显著提高。
图 4 木质素-表面活性剂-植物复合修复技术
2、解析不同类型土壤中有机污染物的环境归趋
分析了我国重要土壤类型（如黑土、潮土、水稻土、红壤等）中多环芳烃、有机氯农药等污染物的生物转化特征。
三、同位素探针识别污染物降解菌
（一）稳定同位素探针
利用同位素质量差异追踪降解菌。DNA-SIP原理是，微生物同化利用含重同位素的有机物，DNA密度变大。采用超速离心法，可以分离重DNA，从而鉴定微生物种类，明确降解菌组成。该方法的优点是结果准确可靠，缺点是成本高且工作量大。
（二）应用
3、利用13C底物鉴定污染土壤中未知的PAH降解菌
某污染土表现出较强的菲、苯并[a]蒽矿化活性。对于不同结构的PAH，降解菌有没有差异？为解决以上问题可以采用DNA-SIP，利用定量计算（qSIP）鉴别活性降解菌。
图 5 定量计算（qSIP）
4、利用18O-H2O追踪已知菌剂在土壤中的生长
所有生命的生长都需要水（H2O），18O-H2O可以无差别地标记土壤中活跃生长微生物（包括外源微生物）。因此提出一种18O标记方法，能够对外加微生物在土壤中的生长情况作精准、定量评估。
图 6 18O标记方法示意图（专利申请号：202210777730.7）
四、同位素分馏-修复评估
（一）利用同位素自然丰度评价降解效果
同位素分馏即利用同位素的自然丰度来评价降解/修复效果。土壤中，C的12C比例是98.9%，13C的比例是1.1%，由此可以计算出12C和13C的比值。实际上，除C以外，污染物中所含的化学元素（C、H、N等）都有稳定的同位素。
图 7 常见化学元素同位素
测定污染物同位素比值的方法为单体同位素分析法（Compound Specific Isotope Analysis，CSIA）。该方法的基本原理是：提取环境中的混合多种污染物的介质，用气相色谱仪分离后获得单一污染物的峰，将其高温燃烧转化为二氧化碳，测定二氧化碳的峰并与污染物的峰做比对，再送检测定质谱，由此获得单一污染物的同位素组成。主要应用的仪器是GC-IRMS（同位素质谱），在国内外多有广泛的认同与应用。
同位素比值是化合物的“指纹”，不同来源农药的同位素比值不一致，相同来源农药的同位素比值一致。国外有研究测定农药“阿特拉津（莠去津）”的同位素比值，研究结果发现不同厂家的阿特拉津同位素比值各不相同。
图 8 不同来源的农药具有不同的同位素比值（Elsner and Imfeld，2016）
美国某场地通过测定同位素比值来实现污染物溯源并完成责任认定。该场地在开发利用前进行场地调查，场地北侧原有污染羽的污染物为TCE，调查中在地块西侧发现新污染物以PCE和TCE为主，污染物种类增多。为辨别西侧污染羽中的污染物源头，在调查中采用同位素比值法，结合部分计算结果证明新污染羽中的PCE并非其他污染源扩散造成而是由独立的PCE排放事件造成。
（二）同位素分馏
1、定义：反应中，剩余反应物的同位素比值（如13C/12C）改变
2、原理：动力学同位素效应（KIE）
3、优势：化学反应固有性质、独立的评价方法
4、缺点：适用的污染物范围有限、有浓度要求
（三）应用
5、利用碳同位素比值评估土壤中PBDE的降解
将BDE-15加到土壤中，调整温度来模拟自然环境中的季节变化，发现温度升高后土壤中的BDE-15浓度有所降低，但误差值较大，所以测定其碳同位素比值进行独立评价。结果显示，BDE-15的13C的同位素比值升高，印证BDE-15确实发生转化。同时，对土壤中的微生物展开研究发现不同温度条件下存在明显差异。
6、展望1：利用碳同位素分馏评估降解机制（Elsner and Imfeld，2016）
除草剂阿特拉津的微生物降解存在两个阶段：氧化去烷基、水解脱氯，如左图所示（红色-氧化去烷基，蓝色-水解脱氯），右图展示了两种降解途径对应的同位素比值变化情况。两种降解途径产生不同的分馏轨迹，有效帮助判断降解机制。
7、展望2：监测污染场地POPs自然衰减过程（Bashir，et al.，2015）
该场地存在地下水污染，收集场地内不同方位的地下水样品来进行跨年份的分析。研究人员连续三年从场地内的监测井中采集地下水样品进行同位素测定，以确定污染物是否在附近，甚至可以区分不同的过程和浓度分析相结合判断浓度降低是否是由降解造成。该方法也是监测自然衰减修复的一种潜在的重要评估手段。
图 9 污染场地示意图
五、一个修复案例
修复对象：某农资仓库受六六六污染的土壤
目标污染物：α-、β-HCH
地块特征：土壤含盐量较高（19.2g/kg）
（一） 实验室研究：利用14C协助确定零价铁用量（同位素示踪）
基于污染地块特征，选取零价铁和微生物结合的方法来处理污染土壤，污染土壤中六六六的浓度会对加入的不同比例零价铁有不同程度的响应。矿化率随着零价铁比例的增加也逐渐增长，虽然结果显示5%零价铁效果最好，但结合多方面因素考虑后选择了2%的用量。2%零价铁的投加有利于生物降解，也可以促进结合残留态的形成。
（二） 实验室研究：利用18O解析零价铁-微生物修复机理（DNA-SIP）
利用18O作为标记底物，采用DNA探针的方法对修复方法的机理进行解析。下图展示出对照组和加铁处理组在不同时间的标记情况（红线-投加18O-H2O），投加18O的组都显示出明显的波峰（B组除外），表明18O-H2O成功捕获土壤中活跃生长的微生物。由此发现，零价铁加入早期抑制微生物生长，后期抑制作用解除。加铁处理组显示，微生物产生非常明显的增长，即零价铁没有完全抹杀微生物的活性。
图 10 不同时间下对照组与加铁处理组的标记情况
通过宏基因组的进一步研究发现，投加零价铁后，土壤中林丹（Lindane）降解直接相关的功能基因（如linB），未检测到明显变化；但针对含氯物质的降解功能基因todC1/bedC1发生了明显的富集，即为微生物代谢氯苯类的功能上调。造成这一现象的可能原因是，投加零价铁后，六六六被转化为多种脱氯的中间产物，微生物可以作用于这些氯苯类物质进一步向下游转化。以上即铁还原-微生物矿化两阶段的作用模式。
图 11 林丹降解宏基因组示意图
（三） 修复工程的开展
基于以上结果，确定了基于零价铁、修复菌剂的交替厌氧—好氧修复方案。将土壤放在异位修复池中，先后加入铁、微生物的营养成分等，随后交替完成淹水和放干。
（四） 修复工程的效果
左图展示了污染物浓度测定的结果，经过四轮的修复后土壤中六六六浓度显著降低。修复前后碳同位素测定发现修复后的13C富集，有效证明污染物六六六得到有效降解。
图 12 浓度测定结果
（五） 小结与展望
1、在POPs污染土壤微生物修复研究中，可以采用：
ü 同位素示踪追踪污染物（敏感性）
ü 同位素探针识别降解菌（可靠性）
ü 同位素分馏评估降解率（独立性）
2、“同位素+”、多同位素方法的联合使用将助力POPs污染土壤的绿色可持续修复
课程总结|高铭晓